cathepsin B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400360-ACT

CTSB codifica a protease cisteína lisossomal catepsina B, um mediador-chave da renovação intracelular de proteínas e da remodelação endolisossomal. A catepsina B participa do catabolismo dependente de lisossomos, da comunicação cruzada entre autofagia e lisossomos e do processamento regulado de proteínas em compartimentos endocíticos, com funções adicionais na renovação da matriz extracelular quando secretada ou redistribuída. Alterações na expressão ou atividade de CTSB têm sido associadas a mudanças no processamento de antígenos, em respostas ligadas ao inflamassoma e em vias de estresse de proteostase que influenciam a sobrevivência celular e a remodelação tecidual. A desregulação da catepsina B é frequentemente estudada no contexto de invasão e metástase do câncer, neurodegeneração e doenças inflamatórias, nas quais alterações na função lisossomal e no equilíbrio de proteases contribuem para fenótipos relevantes para a doença.

cathepsin B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CTSB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cathepsin B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CTSB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CTSB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cathepsin B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CTSB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cathepsin B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cathepsin B em células tumorais com expressão de CTSB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.