Plásmido CRISPR de Activación (h) calsequestrin 2: sc-402912-ACT

CASQ2 codifica la calsequestrina 2, la principal proteína de unión a Ca2+ en la luz del retículo sarcoplásmico de los cardiomiocitos, que amortigua el calcio intraluminal y ayuda a modular el acoplamiento excitación–contracción. Al organizar el almacenamiento y la liberación de Ca2+ en proximidad a los complejos del receptor de rianodina, la calsequestrina 2 influye en la liberación de calcio inducida por calcio, el rellenado del RS y la señalización de la homeostasis del calcio. La alteración de la expresión o la función de CASQ2 modifica la carga de Ca2+ del RS y la dinámica de liberación, contribuyendo a un manejo anómalo del calcio y a fenotipos celulares arritmogénicos. Estas propiedades hacen de CASQ2 un nodo clave para estudiar el ciclo del calcio cardíaco, las respuestas al estrés y los mecanismos que vinculan la desregulación del calcio del RS con trastornos hereditarios del ritmo.

calsequestrin 2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CASQ2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

calsequestrin 2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CASQ2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CASQ2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de calsequestrin 2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CASQ2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de calsequestrin 2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía calsequestrin 2 en células tumorales con expresión de CASQ2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.