Calpain reg Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403478-ACT

CAPNS1 codifica a pequena subunidade regulatória essencial para a estabilidade e a atividade das proteases ubíquas calpaína-1 e calpaína-2, permitindo uma proteólise limitada, dependente de cálcio, de proteínas de sinalização e estruturais. Por meio da clivagem controlada de substratos, a atividade das calpaínas sustentada por CAPNS1 modula a remodelação do citoesqueleto, a renovação de adesões focais, a migração celular e a progressão do ciclo celular, além de interagir com programas de proteostase e de resposta ao estresse. A sinalização por calpaínas também influencia vias inflamatórias e apoptóticas ao remodelar reguladores-chave, conectando a função de CAPNS1 a processos relevantes para a biologia tumoral, a neurodegeneração e modelos de lesão tecidual. Alterações na expressão de CAPNS1 ou a desregulação das calpaínas têm sido associadas a mudanças na invasividade celular, na integridade de barreiras e na suscetibilidade ao estresse proteotóxico, tornando-o um ponto útil para estudos mecanísticos.

Calpain reg O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CAPNS1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Calpain reg O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CAPNS1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CAPNS1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Calpain reg. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CAPNS1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Calpain reg no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Calpain reg em células tumorais com expressão de CAPNS1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.