CA IV CRISPR Activationプラスミド (h): sc-404215-ACT

ヒトCA4は、二酸化炭素（CO₂）の可逆的な水和反応により重炭酸イオン（HCO₃⁻）とプロトン（H⁺）を生成する、GPIアンカー型の細胞外金属酵素である炭酸脱水酵素IV（CA IV）をコードする。CA IVは細胞表面でのCO₂/HCO₃⁻相互変換を促進することで、酸塩基恒常性、上皮のイオン輸送、腎臓や肺などの組織におけるCO₂の処理を支え、代謝や灌流によって形成される微小環境におけるpH調節にも寄与する。CA4活性は、重炭酸輸送系やpH感受性シグナル伝達過程と相互に関与し、輸送体機能の調節や細胞外緩衝能などを通じて細胞生理に影響を及ぼす。炭酸脱水酵素活性の異常やpH制御の変化は、腎・肺の生理に関連する疾患表現型や、細胞外の酸性化が細胞挙動に影響する状況において重要である。

CA IV CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性CA4の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

CA IV CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における CA4 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はCA4転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性CA IVの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のCA4遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるCA IV依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびCA4発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるCA IV経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。