BRAP Double Nickaseプラスミド (h): sc-403847-NIC

BRAP（BRCA1 associated protein）は細胞質に局在するE3ユビキチンリガーゼで、KSR1などの構成因子に結合してユビキチン化することによりMAPKシグナル伝達を調節し、RAF–MEK–ERK経路のシグナル強度（振幅）と持続時間を形成します。ユビキチン依存的なタンパク質の安定性や輸送の制御を通じて、BRAPは細胞周期の進行、分化、ストレス応答性シグナル伝達に影響を及ぼします。遺伝学的・機能解析研究により、BRAPの異常は増殖シグナルの変化やプロテオスタシスの破綻と関連することが示されており、これらはがん生物学および神経血管疾患の機序に関わる過程です。ユビキチン化とMAPK経路制御の交点に位置するという性質から、BRAPはヒト細胞におけるシグナル伝達およびタンパク質代謝回転ネットワークを解明するための有用なノードとなります。

BRAP ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における BRAP 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、BRAP内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、BRAPの機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、BRAPが破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。