Atg13 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-404702-ACT-2

O ATG13 humano codifica a proteína Atg13, um componente central do complexo de iniciação ULK1 que integra sinais de nutrientes e energia provenientes de mTORC1 e AMPK para desencadear a formação de autofagossomos. Ao coordenar eventos iniciais da autofagia e a nucleação do fagóforo por meio de interações com ULK1/2, FIP200/RB1CC1 e ATG101, a Atg13 sustenta a proteostase, o controle de qualidade de organelas e a adaptação ao estresse. A autofagia dependente de ATG13, quando desregulada, tem sido implicada em vias relevantes para a biologia do câncer, neurodegeneração e sinalização inflamatória, nas quais alterações no fluxo autofágico podem impactar a sobrevivência celular e respostas imunes inatas. A edição gênica de ATG13 possibilita estudos mecanísticos da iniciação da autofagia, o mapeamento da comunicação cruzada entre vias de sinalização e triagens de genômica funcional que quantificam o fluxo autofágico, a sensibilidade ao estresse e dependências de vias em modelos celulares humanos.

Atg13 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATG13 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Atg13 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATG13 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATG13, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Atg13. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATG13 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Atg13 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Atg13 em células tumorais com expressão de ATG13 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.