ASM Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401347-ACT

O SMPD1 humano codifica a esfingomielinase ácida (ASM), uma hidrolase lisossomal que cliva a esfingomielina para gerar ceramida e fosforilcolina, regulando assim a homeostase dos esfingolipídios. A atividade da ASM influencia a organização de microdomínios de membrana, o tráfego endolisossomal e vias de sinalização responsivas ao estresse ligadas à apoptose dependente de ceramida, à autofagia e a respostas inflamatórias. A perturbação de SMPD1 altera a função lisossomal e a dinâmica de armazenamento lipídico, com relevância bem estabelecida para distúrbios de armazenamento de esfingolipídios e para mecanismos mais amplos de neurodegeneração e desregulação imunológica. Como um nó central no metabolismo esfingomielina–ceramida, o SMPD1 é comumente estudado pelo seu impacto na adaptação celular ao estresse e na sinalização associada à membrana.

ASM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SMPD1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ASM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SMPD1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SMPD1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ASM. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SMPD1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ASM no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ASM em células tumorais com expressão de SMPD1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.