ASCL3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-425304-ACT

O fator de transcrição bHLH 3 da família achaete-scute (ASCL3) é um regulador mouse do tipo hélice–alça–hélice básica implicado na especificação de linhagens e em programas de diferenciação, particularmente em contextos de células epiteliais e secretoras. Ao se ligar a motivos E-box e coordenar redes transcricionais com outros fatores bHLH, o ASCL3 pode influenciar decisões de destino celular, maturação e manutenção de fenótipos celulares especializados. A expressão desregulada de reguladores bHLH do desenvolvimento é frequentemente associada a estados de diferenciação alterados, proliferação aberrante e reprogramação transcricional relevante para processos oncogênicos e metaplásicos. Assim, o Ascl3 serve como um ponto útil para dissecar vias de desenvolvimento dirigidas por fatores de transcrição e alterações na expressão gênica associadas à diferenciação em sistemas de modelos murinos.

ASCL3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ascl3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ASCL3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ascl3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ascl3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ASCL3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ascl3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ASCL3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ASCL3 em células tumorais com expressão de Ascl3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.