ARFGAP1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403939-ACT

ARFGAP1 codifica a proteína ativadora de GTPase do fator de ADP-ribosilação 1 (ARF GAP1), um regulador-chave do ciclo de ARF1 que promove a hidrólise de GTP para coordenar o brotamento e o desrevestimento de vesículas na via secretória inicial. Ao modular o transporte revestido por COPI, o tráfego Golgi–RE e a dinâmica da curvatura de membrana, a ARFGAP1 ajuda a manter a estrutura do Golgi e a triagem eficiente de cargas. Sua atividade intersecciona com a sinalização de pequenas GTPases e com redes mais amplas de tráfego de membranas que influenciam a reciclagem de receptores e a saída de sinalização intracelular. A desregulação do tráfego dependente de ARF e da homeostase do Golgi tem sido implicada em fenótipos relevantes para a sinalização oncogênica, a neurodegeneração e a exploração, por patógenos, da maquinaria de transporte do hospedeiro, tornando a ARFGAP1 um nó útil para estudos mecanísticos.

ARFGAP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ARFGAP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ARFGAP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ARFGAP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ARFGAP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ARFGAP1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ARFGAP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ARFGAP1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ARFGAP1 em células tumorais com expressão de ARFGAP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.