arfaptin 1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405033-ACT

ARFIP1 codifica a arfaptina 1, uma proteína ligante de pequenas GTPases da família Arf que se associa a lipídios de membrana e participa do tráfego endocítico de membranas e da biogênese de vesículas. Ao acoplar proteínas ARF ativadas à detecção de curvatura de membrana mediada por domínio BAR, a arfaptina 1 ajuda a coordenar a triagem de carga, a reciclagem e a organização de compartimentos do Golgi/endossomais. Esses processos influenciam a renovação (turnover) de receptores e a dinâmica da sinalização intracelular, conectando o tráfego dependente de ARFIP1 a vias que controlam o crescimento celular e respostas ao estresse. O tráfego de membranas desregulado é uma característica comum na biologia de doenças proliferativas e neurodegenerativas, tornando ARFIP1 um ponto útil para estudos mecanísticos de regulação mediada por vesículas.

arfaptin 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ARFIP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

arfaptin 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ARFIP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ARFIP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de arfaptin 1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ARFIP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de arfaptin 1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via arfaptin 1 em células tumorais com expressão de ARFIP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.