ARALAR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403673-ACT

SLC25A12 codifica a ARALAR, um transportador mitocondrial de aspartato–glutamato (AGC1) regulado por cálcio, que dá suporte ao vaivém malato–aspartato e acopla o equilíbrio redox citosólico e mitocondrial. Ao trocar aspartato e glutamato através da membrana interna da mitocôndria, a ARALAR ajuda a sustentar a transferência de NADH, a anaplerose do ciclo do TCA e fluxos biossintéticos ligados ao metabolismo energético neuronal e a vias associadas à mielina. A sua atividade integra a função mitocondrial com a sinalização por cálcio e o metabolismo de aminoácidos, influenciando as respostas celulares ao stress energético. Alterações na expressão ou na função de SLC25A12 têm sido associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento e neurometabólicos e são estudadas em contextos que envolvem disfunção mitocondrial e o processamento de neurotransmissores excitatórios.

ARALAR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC25A12 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ARALAR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC25A12 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC25A12, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ARALAR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC25A12 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ARALAR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ARALAR em células tumorais com expressão de SLC25A12 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.