Apaf-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401291-ACT

APAF1 codifica o fator 1 ativador de protease apoptótica (Apaf-1), um arcabouço central na via intrínseca mitocondrial de apoptose. Após a liberação de citocromo c e a ligação de dATP/ATP, a Apaf-1 oligomeriza-se formando o apoptossomo, que recruta e ativa a caspase-9 iniciadora, propagando cascatas de caspases a jusante que regulam a morte celular programada. Esse nodo integra sinais de estresse celular, a permeabilização da membrana externa mitocondrial e vias de checkpoint que governam a homeostase tecidual e a renovação celular durante o desenvolvimento. A atividade desregulada de APAF1 tem sido associada a alterações na competência apoptótica na biologia do câncer e em modelos relacionados à neurodegeneração, tornando-o relevante para estudos mecanísticos do controle do destino celular.

Apaf-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de APAF1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Apaf-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus APAF1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição APAF1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Apaf-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus APAF1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Apaf-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Apaf-1 em células tumorais com expressão de APAF1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.