Amelogenin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403337-ACT

AMELY codifica a amelogenina, uma proteína secretada da matriz extracelular que contribui para a organização da matriz do esmalte durante a odontogénese e apoia a mineralização do esmalte por meio da regulação do crescimento dos cristais de hidroxiapatita e da remodelação da matriz. A amelogenina participa em interações epitélio–mesenquimatosas estreitamente coordenadas e em eventos de processamento mediados por proteases que moldam a formação do esmalte, ligando a expressão de AMELY a programas de desenvolvimento em tecidos mineralizados. A variação em vias associadas à amelogenina é relevante para a integridade estrutural do esmalte e é frequentemente explorada na genética humana, uma vez que diferenças de sequência entre AMELX/AMELY fornecem marcadores informativos do sexo em fluxos de trabalho forenses e antropológicos. Na investigação biomédica, AMELY serve como um modelo acessível para estudar o controlo transcricional de genes da matriz, o estado de diferenciação e redes génicas associadas à biomineralização.

Amelogenin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AMELY sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Amelogenin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AMELY em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AMELY, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Amelogenin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AMELY nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Amelogenin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Amelogenin em células tumorais com expressão de AMELY silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.