AMBP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403136-ACT

Das menschliche AMBP-Gen codiert den Alpha-1-Mikroglobulin/Bikunin-Vorläufer, ein sezerniertes Glykoprotein, das proteolytisch verarbeitet wird und dabei Alpha-1-Mikroglobulin und Bikunin erzeugt. Alpha-1-Mikroglobulin ist an der Häm-Bindung und an redoxassoziierten extrazellulären Abwehrmechanismen beteiligt und unterstützt so die Kontrolle von oxidativem Stress und entzündlicher Gewebeschädigung, während Bikunin als Kunitz-Typ-Serinprotease-Inhibitor wirkt, der die perizelluläre Proteolyse moduliert. Über diese Aktivitäten ist AMBP mit Signalwegen verknüpft, die den Umbau der extrazellulären Matrix, gerinnungsbezogene Proteasekaskaden und Entzündungsprozesse steuern. Eine dysregulierte AMBP-Expression oder -Prozessierung wurde mit Pathophysiologie von Niere und Leber, systemischen Entzündungszuständen und dem Umbau des Tumormikromilieus in Verbindung gebracht und ist damit relevant für mechanistische Studien zur Proteostase und zu Gewebeschadensantworten.

AMBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AMBP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AMBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AMBP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AMBP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AMBP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AMBP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AMBP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AMBP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AMBP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.