A20/TNFAIP3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423436-ACT

Tnfaip3 codifica A20/TNFAIP3, uma enzima de edição de ubiquitina que limita a sinalização inflamatória ao encerrar a ativação das vias NF-κB e MAPK a jusante de receptores como TNFR, TLRs e IL-1R. Por meio de atividades coordenadas de desubiquitinação e de ligase de ubiquitina, A20 modula cadeias de ubiquitina ligadas por K63 e M1 em intermediários de sinalização, incluindo RIPK1, TRAF6 e NEMO, moldando a produção de citocinas e a homeostase imune. Em compartimentos imunes e estromais de camundongos, a função alterada de A20 está associada a respostas inatas e adaptativas desreguladas, sobrevivência celular aberrante e maior sensibilidade a estímulos inflamatórios. Assim, Tnfaip3 é amplamente estudado em mecanismos de autoimunidade, inflamação crônica e sinalização dependente do contexto no microambiente tumoral.

A20/TNFAIP3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tnfaip3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

A20/TNFAIP3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tnfaip3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tnfaip3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de A20/TNFAIP3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tnfaip3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de A20/TNFAIP3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via A20/TNFAIP3 em células tumorais com expressão de Tnfaip3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.