14-3-3 σ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401096-ACT

SFN codifica a proteína adaptadora humana 14-3-3 sigma (σ), um regulador induzível por p53 que coordena a transdução de sinais ao se ligar a motivos de fosfoserina/fosfotreonina em diversas proteínas alvo. Ela desempenha papéis centrais em checkpoints de dano ao DNA, no controle do ciclo celular em G2/M e na manutenção da diferenciação epitelial, influenciando vias que governam proliferação, apoptose e respostas ao estresse. Ao modular a localização e a atividade de reguladores do ciclo celular e de quinases, a 14-3-3 σ contribui para a estabilidade genômica e para programas supressores de tumor. Alterações na expressão de SFN e seu silenciamento epigenético foram relatados em múltiplos tipos de câncer e também são relevantes para estudos de biologia de queratinócitos, senescência e resposta ao estresse genotóxico.

14-3-3 σ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SFN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

14-3-3 σ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SFN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SFN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de 14-3-3 σ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SFN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de 14-3-3 σ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via 14-3-3 σ em células tumorais com expressão de SFN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.