γ-FR CRISPR Activationプラスミド (h): sc-403347-ACT

ヒトFOLR3はγ-葉酸受容体（γ-FR）をコードしており、糖脂質（GPI）アンカー型の葉酸受容体ファミリーに属する分子です。葉酸結合および細胞内の葉酸恒常性に関与し、ヌクレオチド生合成やメチル化反応に必要な1炭素代謝を支えます。葉酸の利用可能性との結び付きにより、γ-FRはDNA複製・修復、レドックスバランス、エピジェネティック制御に影響する経路とも関連し、これらの過程は急速に増殖する細胞や代謝が再プログラムされた細胞でしばしば攪乱されます。葉酸受容体の発現変動は、造血系および免疫細胞の生物学的文脈や、葉酸代謝とメチル化状態が転写プログラムの変化に寄与する疾患において検討されてきました。さらに、細胞表面に存在する葉酸結合タンパク質としてのγ-FRは、受容体介在性の栄養素取り込みと、その下流にある代謝表現型をヒト細胞モデルで解析するための扱いやすい指標にもなります。

γ-FR CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性FOLR3の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

γ-FR CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における FOLR3 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はFOLR3転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性γ-FRの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のFOLR3遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるγ-FR依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびFOLR3発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるγ-FR経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。