γB-crystallin Double Nickaseプラスミド (h): sc-402939-NIC

CRYGBはヒトγB-クリスタリンをコードする遺伝子であり、γB-クリスタリンは眼の水晶体に非常に豊富に存在し、長期間安定して存在する構造タンパク質です。安定なβ/γ-クリスタリンドメイン構造により、屈折率の維持と組織の透明性に寄与します。γB-クリスタリンは、水晶体線維細胞におけるプロテオスタシスやクリスタリン集合体の空間的な組織化にも関与しており、溶解性、凝集しやすさ、翻訳後修飾の変化は光散乱を変化させ得ます。クリスタリンの恒常性の破綻は白内障の生物学と密接に関連しているため、CRYGBは、水晶体関連の細胞モデルにおけるタンパク質安定性、相挙動、ストレス応答を研究するうえで有用な切り口となります。CRYGBを実験的に解析することは、加齢や酸化条件下でのタンパク質凝集機構や光学的特性の維持機構の解明を支えます。

γB-crystallin ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における CRYGB 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、CRYGB内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、CRYGBの機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、CRYGBが破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。