α_1D-AR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402904-ACT

ADRA1D codifica o receptor adrenérgico humano α1D (α1D-AR), um receptor acoplado à proteína G que se acopla principalmente a Gq/11 para ativar a fosfolipase C, aumentar o Ca2+ intracelular e estimular a sinalização dependente de PKC. Os efeitos a jusante incluem a modulação das vias MAPK/ERK e de programas transcricionais que regulam a contratilidade do músculo liso, o tônus vascular e a neurotransmissão autonómica. A atividade do α1D-AR influencia a fisiologia cardiovascular e urogenital e é estudada no contexto de sinalização adrenérgica desregulada associada à hipertensão, disfunção do trato urinário inferior e outros distúrbios que envolvem alterações na responsividade do músculo liso. A expressão de ADRA1D e a dinâmica da sua sinalização também fornecem um indicador mecanístico do tráfego de GPCR, da dessensibilização e do acoplamento recetor-efetor em células humanas.

α1D-AR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ADRA1D sem alterar a sequência de ADN subjacente.

α1D-AR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ADRA1D em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ADRA1D, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de α1D-AR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ADRA1D nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de α1D-AR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via α1D-AR em células tumorais com expressão de ADRA1D silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.