ZEB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400201-ACT

Lo ZEB1 umano codifica la proteina homeobox a dita di zinco che si lega alle E-box, ZEB, un fattore di trascrizione a specificità di sequenza che si associa a motivi simili alle E-box per coordinare programmi di regolazione genica che controllano la transizione epitelio-mesenchimale (EMT), la polarità cellulare e il differenziamento. ZEB1 integra segnali provenienti dalle vie TGF-β/SMAD, Wnt/β-catenina, Notch e MAPK e interagisce con reti di microRNA come la famiglia miR-200 per modulare la repressione e l’attivazione trascrizionale. Un’attività alterata di ZEB1 è spesso associata a cambiamenti nell’adesione cellulare, nella motilità e nella plasticità di linea, rendendolo rilevante per studi su fibrosi, disturbi dello sviluppo e biologia dei tumori. In quanto regolatore centrale degli stati trascrizionali associati all’EMT, ZEB1 è ampiamente utilizzato come nodo molecolare per indagare programmi di espressione genica dipendenti dal contesto.

ZEB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZEB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ZEB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZEB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZEB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ZEB1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZEB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ZEB1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ZEB1 nelle cellule tumorali con espressione di ZEB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.