WTAP Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-425635-ACT

Wtap codifica a WTAP, um componente central do complexo metiltransferase de RNA de N6-metiladenosina (m6A), que coopera com METTL3/METTL14 para regular o processamento do pré-mRNA, o splicing alternativo, a estabilidade do mRNA e a tradução. A WTAP contribui para a organização de speckles nucleares e coordena programas de regulação gênica pós-transcricional que influenciam a progressão do ciclo celular, a especificação de linhagens e as respostas ao estresse. Em modelos murinos, a perturbação da maquinaria de m6A associada à WTAP afeta o desenvolvimento embrionário e a homeostase tecidual, refletindo seu amplo papel no controle da expressão gênica. A atividade desregulada da via de m6A envolvendo WTAP tem sido associada a alterações de sinalização proliferativa e de estados de diferenciação relevantes para a biologia do câncer e outras doenças impulsionadas por metabolismo aberrante de RNA.

WTAP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Wtap sem alterar a sequência de ADN subjacente.

WTAP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Wtap em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Wtap, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de WTAP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Wtap nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de WTAP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via WTAP em células tumorais com expressão de Wtap silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.