WRN Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401860-ACT

Il gene umano **WRN** codifica l’elicasi ATP-dipendente della sindrome di Werner, un enzima della famiglia **RecQ** con attività di elicasi del DNA 3′–5′ ed esonucleasi che proteggono la stabilità del genoma. WRN partecipa alla replicazione e ricombinazione del DNA, al mantenimento dei telomeri e a molteplici vie della risposta al danno al DNA, inclusi il processamento delle forcelle di replicazione bloccate e la riparazione delle rotture a doppio filamento. Le varianti con perdita di funzione compromettono la riparazione associata alla replicazione e accelerano l’instabilità genomica, collegando la disfunzione di WRN alla sindrome di Werner e, più in generale, a meccanismi di invecchiamento precoce e predisposizione al cancro. WRN è inoltre un nodo chiave per lo studio della segnalazione dello stress replicativo, della dinamica dei telomeri e delle dipendenze di via in contesti con capacità di riparazione del DNA integra rispetto a contesti deficitari.

WRN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WRN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

WRN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WRN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WRN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di WRN. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WRN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da WRN nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via WRN nelle cellule tumorali con espressione di WRN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.