Wnt-5a Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423718-ACT

Wnt5a codifica Wnt-5a, una glicoproteina secreta che segnala principalmente attraverso vie Wnt non canoniche per regolare la polarità cellulare, la migrazione e la morfogenesi dei tessuti. Wnt-5a interagisce con recettori come ROR1/2 e Frizzled per attivare la polarità planare delle cellule e cascate di segnalazione dipendenti dal Ca²⁺, influenzando la dinamica del citoscheletro e il movimento direzionale. Nel topo, Wnt5a è essenziale per il patterning embrionale, lo sviluppo degli arti e l’organogenesi, e la sua disregolazione è spesso studiata in contesti di infiammazione, fibrosi e segnalazione nel microambiente tumorale. Un’attività alterata di Wnt-5a può anche modulare il crosstalk con la segnalazione della β-catenina, plasmando la differenziazione e il comportamento di cellule staminali/progenitrici in modelli rilevanti per lo sviluppo e per la malattia.

Wnt-5a Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Wnt5a senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wnt-5a Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Wnt5a nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Wnt5a, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wnt-5a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Wnt5a nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wnt-5a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wnt-5a nelle cellule tumorali con espressione di Wnt5a silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.