VPS28 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404226-ACT

Il VPS28 umano codifica una subunità centrale del complesso ESCRT-I, che coordina lo smistamento endosomiale delle proteine di membrana ubiquitinate e promuove la biogenesi dei corpi multivescicolari nel percorso verso la degradazione lisosomiale. Attraverso l’attività della via ESCRT, VPS28 contribuisce a regolare la downmodulation dei recettori, il rimodellamento di membrana e gli eventi di traffico che influenzano l’attenuazione del segnale e la proteostasi. La funzione di ESCRT-I si interfaccia inoltre con l’abscissione citochinetica e con i processi di gemmazione virale, che sfruttano la macchina di scissione di membrana dell’ospite. La disregolazione del traffico endolisosomiale e dei componenti ESCRT è associata ad alterazioni della segnalazione dei fattori di crescita e a fenotipi di stress cellulare rilevanti per la ricerca su cancro e neurodegenerazione.

VPS28 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VPS28 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VPS28 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VPS28 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VPS28, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VPS28. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VPS28 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VPS28 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VPS28 nelle cellule tumorali con espressione di VPS28 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.