VPS13D Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406990-ACT

O VPS13D humano codifica uma grande proteína de transporte de lipídios que se localiza em sítios de contato entre membranas e sustenta a homeostase mitocondrial ao facilitar a transferência de fosfolipídios e a dinâmica de organelas. O VPS13D está implicado no equilíbrio entre fissão e fusão mitocondrial, no controle de qualidade ligado à mitofagia e no metabolismo energético celular, conectando-o a vias que regulam respostas ao estresse oxidativo e o tráfego dependente do citoesqueleto. A interrupção ou desregulação de VPS13D tem sido associada a fenótipos do neurodesenvolvimento e neurodegenerativos, o que é consistente com a alta sensibilidade dos neurônios à disfunção mitocondrial. Como resultado, o VPS13D é frequentemente estudado em modelos de manutenção axonal, estresse bioenergético e comunicação entre organelas.

VPS13D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VPS13D sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VPS13D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VPS13D em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VPS13D, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VPS13D. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VPS13D nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VPS13D no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VPS13D em células tumorais com expressão de VPS13D silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.