Plasmide CRISPR d'Activation (h) VPS13D: sc-406990-ACT

La VPS13D humaine code une grande protéine de transport des lipides qui se localise aux sites de contact membranaire et soutient l’homéostasie mitochondriale en facilitant le transfert de phospholipides et la dynamique des organites. VPS13D est impliquée dans l’équilibre fission/fusion des mitochondries, le contrôle qualité lié à la mitophagie et le métabolisme énergétique cellulaire, ce qui la relie aux voies régissant les réponses au stress oxydatif et le trafic dépendant du cytosquelette. Une perturbation ou une dérégulation de VPS13D a été associée à des phénotypes neurodéveloppementaux et neurodégénératifs, en accord avec la forte sensibilité des neurones aux dysfonctionnements mitochondriaux. En conséquence, VPS13D est fréquemment étudiée dans des modèles portant sur le maintien axonal, le stress bioénergétique et le dialogue entre organites.

VPS13D Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VPS13D sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VPS13D Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VPS13D dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VPS13D, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VPS13D. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VPS13D natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VPS13D au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VPS13D dans les cellules tumorales présentant une expression de VPS13D silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.