VPS13D Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406990-ACT

VPS13D umano codifica una grande proteina di trasporto lipidico che si localizza nei siti di contatto tra membrane e sostiene l’omeostasi mitocondriale facilitando il trasferimento di fosfolipidi e la dinamica degli organelli. VPS13D è implicata nell’equilibrio tra fissione e fusione mitocondriale, nel controllo di qualità legato alla mitofagia e nel metabolismo energetico cellulare, collegandosi a vie che regolano le risposte allo stress ossidativo e il traffico dipendente dal citoscheletro. L’alterazione o la disregolazione di VPS13D è stata associata a fenotipi neuroevolutivi e neurodegenerativi, in linea con l’elevata sensibilità dei neuroni alla disfunzione mitocondriale. Di conseguenza, VPS13D viene spesso studiata in modelli di mantenimento assonale, stress bioenergetico e comunicazione tra organelli.

VPS13D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VPS13D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VPS13D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VPS13D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VPS13D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VPS13D. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VPS13D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VPS13D nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VPS13D nelle cellule tumorali con espressione di VPS13D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.