VPRBP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403283-ACT

A DCAF1 humana, também conhecida como VPRBP, codifica um receptor de substrato para o complexo ligase E3 de ubiquitina CUL4–DDB1, que direciona a ubiquitinação e a degradação proteassomal de diversas proteínas nucleares. Por meio dessa função adaptadora, a VPRBP ajuda a coordenar o licenciamento da replicação do DNA, a regulação da cromatina, as respostas a danos no DNA e a progressão do ciclo celular, conectando a proteostase mediada por ubiquitina ao controle transcricional. A VPRBP também tem sido implicada em crosstalk de sinalização com quinases e em programas imunes e de resposta ao estresse, por meio da degradação regulada de componentes das vias. A desregulação da ubiquitinação dependente de DCAF1/VPRBP está associada a alterações na proliferação e na manutenção do genoma, tornando-a um nó útil para estudar sinalização oncogênica, regulação gênica dependente de cromatina e interações hospedeiro–patógeno.

VPRBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DCAF1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VPRBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DCAF1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DCAF1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VPRBP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DCAF1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VPRBP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VPRBP em células tumorais com expressão de DCAF1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.