V-ATPase D Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403291-ACT

ATP6V1D codifica la subunità D del dominio V1 della H+-ATPasi vacuolare (V-ATPasi), un’ATPasi rotatoria che accoppia l’idrolisi dell’ATP al pompaggio di protoni attraverso le membrane intracellulari. Sostenendo l’acidificazione degli organelli, la subunità D della V-ATPasi contribuisce alla maturazione endosoma–lisosoma, al flusso autofagico, al riciclo dei recettori e al traffico dipendente dal pH lungo le vie secretorie ed endocitiche. Il controllo del pH mediato dalla V-ATPasi influenza anche il sensing dei nutrienti, incluso il segnale di mTORC1 sulla superficie lisosomiale, e modula l’attività delle proteasi all’interno dei compartimenti acidi. La disfunzione della V-ATPasi e l’alterata acidificazione vescicolare sono state associate a cambiamenti della proteostasi, a processi neurodegenerativi e a fenotipi metabolici e invasivi legati al cancro, rendendo ATP6V1D un nodo utile per studi meccanicistici dell’omeostasi cellulare.

V-ATPase D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP6V1D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

V-ATPase D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP6V1D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP6V1D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di V-ATPase D. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP6V1D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da V-ATPase D nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via V-ATPase D nelle cellule tumorali con espressione di ATP6V1D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.