USP47 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403157-ACT

USP47 codifica una proteasi umana specifica per l’ubiquitina che inverte l’ubiquitinazione per regolare la stabilità delle proteine, la localizzazione subcellulare e l’intensità della segnalazione. Attraverso la deubiquitinazione di substrati chiave, USP47 è stata collegata al controllo delle risposte al danno al DNA, della progressione del ciclo cellulare e di vie adattative allo stress che plasmano la proteostasi e il mantenimento del genoma. Un’alterata attività di USP47 può modificare il turnover dipendente dall’ubiquitina e la segnalazione dei checkpoint, processi spesso perturbati nella biologia del cancro e in altri disturbi che coinvolgono un controllo difettoso della qualità proteica. Di conseguenza, USP47 è comunemente studiata in contesti in cui la regolazione mediata dall’ubiquitina influenza la fitness cellulare, l’integrità della replicazione e i programmi trascrizionali.

USP47 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USP47 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USP47 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USP47 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USP47, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USP47. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USP47 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USP47 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USP47 nelle cellule tumorali con espressione di USP47 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.