UPIb Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404274-ACT

UPK1B codifica a uroplaquina-1B (UPIb), uma proteína integral de membrana do tipo tetraspanina que se associa a outras uroplaquinas para formar placas uroteliais na superfície apical das células umbrella. Essas placas contribuem para a integridade da barreira epitelial, a organização da membrana e eventos de tráfego vesicular que regulam a remodelação da superfície no trato urinário. A expressão de UPK1B é altamente enriquecida no urotélio diferenciado e é comumente usada como marcador de linhagem urotelial e de programas de diferenciação epitelial. Padrões alterados de expressão de uroplaquinas têm sido relatados em patologias uroteliais e são estudados no contexto da homeostase do epitélio da bexiga, metaplasia e alterações associadas a tumores no estado de diferenciação.

UPIb O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UPK1B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UPIb O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UPK1B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UPK1B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UPIb. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UPK1B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UPIb no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UPIb em células tumorais com expressão de UPK1B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.