UPF0493 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405363-ACT

EPG5 codifica a UPF0493, uma grande proteína de hélice‑enrolada (coiled‑coil) que atua como reguladora crítica da autofagia ao coordenar a maturação tardia do autofagossomo e a fusão autofagossomo–lisossomo. Por meio do seu papel no fluxo autofágico, a EPG5 influencia a proteostase, a renovação de organelas e as respostas celulares ao estresse, que se conectam às vias de tráfego lisossomal e do sistema endomembranar. A interrupção da autofagia dependente de EPG5 tem sido associada à depuração prejudicada de agregados proteicos e de organelas danificadas, processos especialmente importantes para a homeostase neuronal. Como resultado, EPG5/UPF0493 é frequentemente estudada no contexto de fenótipos do neurodesenvolvimento e neurodegenerativos, bem como em mecanismos mais amplos de disfunção lisossomal.

UPF0493 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EPG5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UPF0493 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EPG5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EPG5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UPF0493. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EPG5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UPF0493 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UPF0493 em células tumorais com expressão de EPG5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.