Type I 4-phosphatase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404750-ACT

INPP4A codifica la 4-fosfatasi di tipo I, una fosfatasi lipidica che idrolizza il fosfatidilinositolo 3,4-bisfosfato in fosfatidilinositolo 3-fosfato, contribuendo così a modellare i pool di fosfoinositidi che regolano il traffico di membrana e la trasduzione del segnale. Modulando il reclutamento, dipendente da PtdIns(3,4)P2, delle proteine contenenti il dominio di omologia con la pleckstrina (PH), INPP4A influenza la dinamica della segnalazione PI3K/AKT, il traffico endocitico e le cascate di fosforilazione a valle che incidono sui programmi di crescita e sopravvivenza cellulare. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di INPP4A sono state collegate a una deregolazione della segnalazione dei fosfoinositidi osservata in diversi contesti associati a malattia, inclusi la biologia tumorale e fenotipi neurologici, rendendolo rilevante per studi meccanicistici sul riassetto delle vie di segnalazione.

Type I 4-phosphatase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di INPP4A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Type I 4-phosphatase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus INPP4A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione INPP4A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Type I 4-phosphatase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus INPP4A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Type I 4-phosphatase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Type I 4-phosphatase nelle cellule tumorali con espressione di INPP4A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.