Tropomyosin α Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423481-ACT

Tpm1 codifica a tropomiosina α, uma proteína em hélice-enrolada (coiled-coil) que se liga à actina, estabiliza a actina filamentosa e determina as interações actomiosina em células estriadas e não musculares. Ao regular a mecânica dos filamentos finos, a organização do citoesqueleto e a transmissão de força contrátil, a TPM1 contribui para processos como o controlo da forma celular, a migração, a dinâmica de adesão e a contração muscular. A função da TPM1 cruza-se com vias de remodelação do citoesqueleto de actina, incluindo sinalização dependente de GTPases Rho e programas de montagem sarcomérica. Alterações na expressão de TPM1 ou no equilíbrio entre isoformas têm sido associadas a defeitos na organização miofibrilar e na fisiologia de cardiomiócitos, apoiando a sua relevância em modelos de cardiomiopatia e mecanismos de doença do citoesqueleto.

Tropomyosin α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tpm1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Tropomyosin α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tpm1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tpm1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Tropomyosin α. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tpm1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Tropomyosin α no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Tropomyosin α em células tumorais com expressão de Tpm1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.