Tollip Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402638-ACT

O TOLLIP humano codifica a proteína Toll-interacting (Tollip), um adaptador endossomal que modula a sinalização imune inata a jusante dos recetores do tipo Toll (TLR) e da família de recetores de IL-1. A Tollip liga-se a carga ubiquitinada e interage com a maquinaria do sistema ubiquitina–proteassoma e do tráfego endolisossomal para influenciar a renovação/reciclagem de recetores, a amplitude do sinal e a expressão de genes inflamatórios. Por meio das suas funções na regulação das vias TLR/IL-1R–NF-κB e MAPK, o TOLLIP contribui para decisões celulares que moldam a produção de citocinas e a tolerância imunitária. A atividade desregulada de TOLLIP tem sido associada a respostas inflamatórias alteradas e tem sido investigada em contextos que incluem biologia de infeções, inflamação crónica e mecanismos de doenças mediadas pelo sistema imunitário.

Tollip O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TOLLIP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Tollip O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TOLLIP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TOLLIP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Tollip. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TOLLIP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Tollip no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Tollip em células tumorais com expressão de TOLLIP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.