TMEM205 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408587-ACT

TMEM205 codifica una proteina transmembrana multi-pass prevista, localizzata nelle membrane cellulari, dove si ritiene influenzi il traffico di membrana e i processi legati al trasporto che contribuiscono all’omeostasi dei compartimenti intracellulari. L’espressione di TMEM205 è stata collegata a risposte alterate allo stress cellulare e a fenotipi di trasporto dei farmaci, implicandola in vie che modulano l’esposizione delle cellule agli xenobiotici. In biologia del cancro, TMEM205 viene spesso studiata per le associazioni con la risposta alla chemioterapia, in particolare in contesti in cui la dinamica di membrana e la gestione vescicolare influenzano l’accumulo dei farmaci. Queste caratteristiche rendono TMEM205 un bersaglio utile per indagare come le proteine associate alla membrana regolino l’adattamento cellulare a stressori ambientali e farmacologici.

TMEM205 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TMEM205 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TMEM205 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TMEM205 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TMEM205, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TMEM205. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TMEM205 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TMEM205 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TMEM205 nelle cellule tumorali con espressione di TMEM205 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.