TM9SF4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-406168-ACT-2

O TM9SF4 humano (membro 4 da superfamília transmembrana 9) codifica uma proteína de membrana multipasso enriquecida em compartimentos endossomais/lisossomais, onde contribui para o tráfego vesicular, a acidificação de organelos e o turnover de proteínas de membrana. O TM9SF4 tem sido associado à regulação da endocitose e das vias de autofagia–lisossomo, afetando a homeostase celular e as respostas ao stress através do controlo do pH intracelular e da triagem de cargas. Alterações na expressão ou na função de TM9SF4 têm sido relacionadas com fenótipos de sobrevivência de células tumorais e com contextos de sinalização ligados ao sistema imunitário, tornando-o relevante para o estudo da biologia das células cancerígenas e da adaptação ao microambiente. A edição genética de TM9SF4 permite a investigação mecanística da dinâmica endolisossomal, da proteostase dependente do pH e dos efeitos a jusante na reciclagem de recetores, na deteção de nutrientes e nas transições de estado celular em modelos de células humanas.

TM9SF4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TM9SF4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TM9SF4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TM9SF4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TM9SF4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TM9SF4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TM9SF4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TM9SF4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TM9SF4 em células tumorais com expressão de TM9SF4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.