Tenascin-R Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402968-ACT

TNR codifica a Tenascina-R, uma glicoproteína da matriz extracelular enriquecida no sistema nervoso central que modula interações célula–célula e célula–matriz durante o desenvolvimento neural e a organização sináptica no adulto. A Tenascina-R contribui para a orientação axonal, o crescimento de neuritos, a mielinização e a arquitetura das redes perineuronais ao coordenar adesão e sinalização com proteoglicanos e outros componentes da matriz. Por meio dessas funções, influencia a plasticidade neuronal, a maturação de circuitos inibitórios e a comunicação glia–neurônio, processos frequentemente estudados na biologia de doenças do neurodesenvolvimento e neurodegenerativas. Alterações na remodelação da matriz extracelular e na dinâmica das redes perineuronais associadas à desregulação de TNR são relevantes para pesquisas sobre epilepsia, transtornos psiquiátricos e plasticidade associada a lesões, sem implicar desfechos clínicos.

Tenascin-R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TNR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Tenascin-R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TNR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TNR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Tenascin-R. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TNR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Tenascin-R no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Tenascin-R em células tumorais com expressão de TNR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.