TDO2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402482-ACT

A TDO2 humana (triptofano 2,3-dioxigenase) é uma enzima dependente de heme que catalisa a primeira etapa — e etapa limitante da velocidade — do catabolismo do triptofano pela via da quinurenina, convertendo L-triptofano em N-formilquinurenina. Ao regular a disponibilidade intracelular e extracelular de triptofano e a produção de quinurenina, a TDO2 influencia o equilíbrio redox, a adaptação metabólica e o fornecimento de ligantes para a sinalização do receptor de hidrocarbonetos arílicos (AHR). A atividade da TDO2 conecta o metabolismo de aminoácidos a programas imunes e de resposta ao estresse por meio de metabólitos subsequentes da quinurenina, que podem modular precursores da biossíntese de NAD+ e a sinalização celular. A desregulação do fluxo triptofano–quinurenina envolvendo a TDO2 tem sido associada a estados inflamatórios, processos relacionados à neurobiologia e remodelamento metabólico associado a tumores, sustentando seu uso como um nó mecanístico em estudos de vias.

TDO2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TDO2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TDO2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TDO2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TDO2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TDO2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TDO2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TDO2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TDO2 em células tumorais com expressão de TDO2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.