TBX5 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423282-ACT

Tbx5 codifica il fattore di trascrizione della famiglia T-box TBX5, un regolatore che si lega al DNA in modo sequenza-specifico e coordina programmi genici dello sviluppo che controllano, nel topo, la formazione delle camere cardiache, la maturazione del sistema di conduzione e la morfogenesi degli arti anteriori. TBX5 agisce in concerto con cofattori come NKX2-5 e GATA4 per regolare reti di enhancer e stati della cromatina che determinano la specificazione di linea e il patterning dei tessuti. La sua attività si integra in vie di controllo trascrizionale che governano la differenziazione dei cardiomiociti, l’accoppiamento elettrico e la morfogenesi strutturale. Alterazioni del dosaggio di TBX5 o della sua funzione regolatoria sono associate a malformazioni congenite del cuore e degli arti, rendendolo un nodo chiave per modellare la disregolazione dello sviluppo in vivo e in sistemi basati su cellule staminali.

TBX5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tbx5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TBX5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tbx5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tbx5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TBX5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tbx5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TBX5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TBX5 nelle cellule tumorali con espressione di Tbx5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.