Plasmide CRISPR d'Activation (h) Swiprosin-1: sc-404763-ACT

EFHD2 code la protéine Swiprosin-1, une protéine adaptatrice liant le calcium impliquée dans le remodelage dynamique du cytosquelette d’actine et dans la coordination de la transduction du signal au niveau de la membrane plasmique. Swiprosin-1 a été associée à des processus tels que l’étalement cellulaire, l’adhérence et la motilité, ce qui concorde avec des rôles dans la signalisation dépendante du calcium et l’organisation du cytosquelette. Dans des contextes immunitaires et neuronaux, la régulation des états d’activation cellulaire associée à EFHD2 a été étudiée en lien avec la signalisation inflammatoire et la fonction synaptique ou axonale. Des profils d’expression altérés d’EFHD2 ont été rapportés dans plusieurs contextes pertinents pour la maladie, ce qui étaye son intérêt en tant que nœud moléculaire permettant de disséquer les voies qui couplent les flux de calcium aux réponses cytosquelettiques et transcriptionnelles.

Swiprosin-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EFHD2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Swiprosin-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EFHD2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EFHD2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Swiprosin-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EFHD2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Swiprosin-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Swiprosin-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de EFHD2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.