Plásmido CRISPR de Activación (h) ST: sc-400733-ACT

SLC6A4 codifica el transportador de serotonina dependiente de sodio y cloruro (ST, también conocido como SERT), un simportador de la membrana plasmática que termina la señalización serotoninérgica mediante la recaptación de 5‑hidroxitriptamina desde el espacio extracelular. Al regular la disponibilidad de serotonina, el ST modula la neurotransmisión, la plasticidad sináptica y las redes de señalización posteriores vinculadas a respuestas transcripcionales dependientes de cAMP/PKA y de MAPK. Además de en las células neuronales, la actividad de SLC6A4 influye en procesos serotoninérgicos periféricos en plaquetas y tejidos gastrointestinales que se entrecruzan con vías neuroinmunes y de respuesta al estrés. La alteración de la expresión o función de SLC6A4 se asocia con susceptibilidad a fenotipos neuropsiquiátricos y conductuales, lo que lo convierte en una diana relevante para estudios mecanísticos sobre la regulación de circuitos serotoninérgicos.

ST El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC6A4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ST El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC6A4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC6A4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ST. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC6A4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ST en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ST en células tumorales con expresión de SLC6A4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.