SPPL2b Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405646-ACT

O SPPL2B humano codifica a protease aspártica intramembranar SPPL2b, uma enzima do tipo peptidase semelhante à peptidase de peptídeo sinal que cliva determinadas proteínas de membrana do tipo II dentro da bicamada lipídica. Ao regular a renovação de substratos e a sinalização de fragmentos de proteínas de membrana, a SPPL2b contribui para a proteostase, o tráfego endossomal/lisossomal e eventos de processamento associados a receptores que moldam a comunicação celular. A atividade da SPPL2b cruza-se com vias que controlam o controle de qualidade de proteínas e a dinâmica de membrana relevante para a imunidade, tornando-a pertinente para estudos de regulação inflamatória e neurobiologia, nos quais a proteólise intramembranar pode modular os desfechos de sinalização. O processamento e o tráfego desregulados de proteínas de membrana são frequentemente implicados em doenças complexas, posicionando o SPPL2B como um nó útil para investigação mecanística em modelos celulares relevantes para doenças.

SPPL2b O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPPL2B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SPPL2b O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPPL2B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPPL2B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SPPL2b. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPPL2B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SPPL2b no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SPPL2b em células tumorais com expressão de SPPL2B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.