SMPDL3B CRISPR Activationプラスミド (m): sc-430315-ACT

マウスSmpdl3bは、スフィンゴミエリン・ホスホジエステラーゼ酸性様3B（SMPDL3B）をコードしており、細胞表面およびエンドリソソーム系コンパートメントにおけるスフィンゴ脂質・リン脂質代謝の制御に関与するとされる膜関連型のホスホジエステラーゼ様タンパク質です。SMPDL3Bは自然免疫シグナル伝達や膜マイクロドメインの構成を調節する因子としても関連づけられており、受容体トラフィッキング、炎症経路のチューニング、細胞骨格ダイナミクスなどの過程に影響を与えます。骨髄系細胞や組織常在性免疫細胞では、SMPDL3B活性の変化が脂質依存的なシグナル伝達の閾値を動かし、微生物由来刺激や組織ストレスに対する応答のあり方を左右し得ます。脂質の取り扱いと免疫恒常性の破綻は、炎症関連表現型や代謝—免疫クロストークをマウスモデルで解明するための機構研究において、Smpdl3bを重要な標的と位置づけます。

SMPDL3B CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Smpdl3bの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

SMPDL3B CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Smpdl3b 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はSmpdl3b転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性SMPDL3Bの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のSmpdl3b遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるSMPDL3B依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびSmpdl3b発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるSMPDL3B経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。