SMO/Smoothened Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400491-ACT

SMO (Smoothened) é um transdutor de sinal de sete domínios transmembrana na via Hedgehog que retransmite sinais de PTCH1 para os fatores de transcrição GLI a jusante. Após a estimulação pelo ligante Hedgehog, o SMO se acumula nos cílios primários e promove programas transcricionais que controlam o padrão embrionário, a manutenção de células-tronco/progenitoras e decisões de destino celular. A atividade do SMO integra-se com cAMP/PKA, a repressão mediada por SUFU e o tráfego dependente da ciliogênese para moldar a saída da via. A sinalização aberrante de SMO está implicada em defeitos do desenvolvimento e na desregulação oncogênica da via Hedgehog, tornando-o um nó-chave para a investigação da via em modelos celulares humanos.

SMO/Smoothened O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SMO sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SMO/Smoothened O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SMO em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SMO, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SMO/Smoothened. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SMO nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SMO/Smoothened no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SMO/Smoothened em células tumorais com expressão de SMO silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.