Sgk223 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406338-ACT

PRAG1 codifica la proteina umana Sgk223, un fattore di impalcatura con caratteristiche simili a una chinasi serina/treonina atipica, implicato nella segnalazione prossimale ai recettori e nella regolazione del citoscheletro. Sgk223 interagisce con adattatori contenenti domini SH3 e con reti di tirosin-chinasi, influenzando l’adesione cellulare, la migrazione e le cascate di segnalazione legate alla crescita, incluse le vie a valle dei recettori tirosin-chinasici. Un’attività PRAG1/Sgk223 deregolata e profili di espressione alterati sono stati riportati in contesti pertinenti alla segnalazione oncogenica e alla motilità cellulare aberrante, a supporto del suo impiego come nodo molecolare per studiare la plasticità della segnalazione e fenotipi associati all’invasione. PRAG1 è quindi di interesse per ricerche meccanicistiche che collegano la segnalazione prossimale alla membrana ai programmi trascrizionali e al comportamento cellulare.

Sgk223 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRAG1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sgk223 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRAG1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRAG1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sgk223. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRAG1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sgk223 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sgk223 nelle cellule tumorali con espressione di PRAG1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.