Sgk223 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406338-ACT

PRAG1 codifica a proteína humana Sgk223, um fator de ancoragem (scaffold) semelhante a uma quinase atípica de serina/treonina, implicado na sinalização proximal aos receptores e na regulação do citoesqueleto. A Sgk223 interage com adaptadores que contêm domínios SH3 e com redes de tirosina-quinases para influenciar a adesão celular, a migração e cascatas de sinalização relacionadas ao crescimento, incluindo vias a jusante de receptores tirosina-quinase. Atividade desregulada de PRAG1/Sgk223 e padrões de expressão alterados foram relatados em contextos relevantes para a sinalização oncogênica e para a motilidade celular aberrante, sustentando seu uso como um nó molecular para estudar plasticidade de sinalização e fenótipos associados à invasão. Assim, PRAG1 é de interesse para pesquisas mecanísticas que conectam a sinalização próxima à membrana a programas transcricionais e ao comportamento celular.

Sgk223 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRAG1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Sgk223 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRAG1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRAG1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Sgk223. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRAG1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Sgk223 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Sgk223 em células tumorais com expressão de PRAG1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.