SAV1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-425662-ACT

Sav1 codifica a proteína 1 contendo domínio WW da família Salvador (SAV1), um componente de ancoragem (scaffold) da via de sinalização Hippo que coopera com as quinases MST1/2 e LATS para regular a atividade de YAP/TAZ e os resultados transcricionais que controlam proliferação, apoptose e crescimento tecidual. Em células de camundongo, a SAV1 sustenta a inibição por contato e a homeostase epitelial ao coordenar a montagem de complexos de quinases e cascatas de fosforilação que restringem programas de expressão gênica pró-crescimento. A desregulação da sinalização Hippo ligada à SAV1 está associada a alterações no controle do tamanho dos órgãos, respostas regenerativas aberrantes e fenótipos relacionados a tumores em modelos experimentais, tornando Sav1 um nó útil para estudar controle de crescimento e mecanotransdução. A SAV1 também se conecta à dinâmica do citoesqueleto e à sinalização em junções, oferecendo uma via para investigar como a polaridade celular e pistas mecânicas influenciam o estado transcricional.

SAV1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Sav1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SAV1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Sav1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Sav1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SAV1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Sav1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SAV1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SAV1 em células tumorais com expressão de Sav1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.