SARM Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403427-ACT

O gene humano SARM1 codifica a proteína 1 contendo motivos alfa estéril e TIR (SARM), um regulador central da degeneração axonal programada por meio de sua atividade intrínseca de NADase, que promove a rápida depleção de NAD⁺ após lesão neuronal. A SARM integra sinais de estresse a montante provenientes de vias de manutenção axonal, incluindo a homeostase de NAD⁺ dependente de NMNAT2, e promove colapso metabólico com efeitos a jusante sobre a função mitocondrial e a integridade do citoesqueleto. A sinalização desregulada de SARM1 está associada a processos relevantes para a neurodegeneração, como a degeneração Walleriana, a neuropatia induzida por quimioterapia e a lesão axonal traumática, tornando-a um alvo útil para estudar fenótipos neuronais adjacentes à neuroinflamação e dependentes do metabolismo energético. A modulação da expressão de SARM1 permite a investigação mecanística de programas de sobrevivência axonal, respostas neuronais ao estresse e sinalização dependente de NAD⁺ em diversos modelos celulares.

SARM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SARM1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SARM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SARM1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SARM1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SARM. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SARM1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SARM no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SARM em células tumorais com expressão de SARM1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.