RNF168 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402174-ACT

RNF168 codifica uma ligase de ubiquitina E3 que amplifica a sinalização de dano ao DNA na cromatina ao ubiquitinar substratos do tipo histona H2A em locais de quebras de dupla fita. Essa cascata dependente de ubiquitina promove o recrutamento e a retenção de fatores-chave de reparo, sustentando vias coordenadas de resposta ao dano no DNA, incluindo sinalização por ATM, controle de checkpoints e a escolha da via de reparo. A atividade de RNF168 está intimamente ligada à estabilidade do genoma, e alterações em sua função podem desorganizar a sinalização de dano baseada em cromatina e comprometer um reparo fiel. A desregulação da sinalização de ubiquitina associada ao RNF168 tem sido estudada no contexto de defeitos hereditários de reparo do DNA e da biologia tumoral, tornando-a relevante para investigações mecanísticas da manutenção genômica.

RNF168 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RNF168 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RNF168 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RNF168 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RNF168, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RNF168. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RNF168 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RNF168 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RNF168 em células tumorais com expressão de RNF168 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.