RIP3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-425224-ACT

O gene Ripk3 de camundongo codifica a RIP3, uma quinase de serina/treonina que atua como regulador central da necrose programada (necroptose) a jusante da sinalização de receptores de morte e da imunidade inata. Quando ativada, a RIP3 forma o necrossomo com a RIPK1 e fosforila a MLKL para promover a ruptura da membrana, além de interagir com respostas inflamatórias mediadas por NF-κB e vias de estresse metabólico. A sinalização dependente de RIP3 molda a produção de citocinas e o destino de células imunes em contextos como infecção, inflamação estéril e lesão tecidual. A desregulação da atividade de RIPK3 tem sido implicada em fenótipos inflamatórios e neurodegenerativos, dano por isquemia-reperfusão e inflamação associada a tumores, tornando o Ripk3 um nó-chave para estudos mecanísticos de morte celular e imunidade inata.

RIP3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ripk3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RIP3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ripk3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ripk3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RIP3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ripk3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RIP3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RIP3 em células tumorais com expressão de Ripk3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.