RB1CC1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416259-ACT

A RB1CC1 humana (também conhecida como FIP200) é um componente central do complexo de iniciação da autofagia ULK1 e coordena a formação precoce do autofagossoma em resposta a sinais de nutrientes e energia. Por meio de interações com ULK1/2, ATG13 e ATG101, a RB1CC1 conecta a sinalização regulada por AMPK e mTOR ao fluxo autofágico, além de contribuir para a organização do citoesqueleto e o manejo seletivo de cargas. A autofagia dependente de RB1CC1 influencia o controle de qualidade mitocondrial, a proteostase e a adaptação ao estresse celular. A desregulação de vias associadas à RB1CC1 tem sido implicada em contextos relevantes para a biologia tumoral e a neurobiologia, sustentando seu uso como um nó mecanístico para estudar controle de crescimento, respostas ao estresse e a comunicação cruzada entre vias.

RB1CC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RB1CC1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RB1CC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RB1CC1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RB1CC1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RB1CC1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RB1CC1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RB1CC1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RB1CC1 em células tumorais com expressão de RB1CC1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.