Rad54 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401750-ACT

RAD54L codifica l’ATPasi umana Rad54 DNA‑dipendente, un fattore di rimodellamento della cromatina della famiglia SWI2/SNF2 che collabora con RAD51 per promuovere la ricerca di omologia, la formazione del D‑loop e la migrazione del ramo durante la ricombinazione omologa. Rad54 agisce nella risposta al danno del DNA per risolvere lesioni associate alla replicazione e rotture a doppio filamento, sostenendo la stabilità del genoma tramite vie di riparazione attive nelle fasi S e G2. Un’alterata attività di RAD54L può compromettere la fedeltà della ricombinazione e contribuire al carico mutazionale e ai riarrangiamenti cromosomici osservati in oncologia e nei contesti ereditari di instabilità genomica. RAD54L è quindi ampiamente studiato nei meccanismi di stress replicativo, riparazione mediata dalla ricombinazione e nella scelta di via tra ricombinazione omologa e giunzione delle estremità (end‑joining).

Rad54 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAD54L senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rad54 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAD54L nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAD54L, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rad54. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAD54L nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rad54 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rad54 nelle cellule tumorali con espressione di RAD54L silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.