Rad54 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401750-ACT

RAD54L codifica a ATPase humana Rad54 dependente de DNA, um fator de remodelamento de cromatina da família SWI2/SNF2 que atua em parceria com RAD51 para promover a busca por homologia, a formação do D-loop e a migração de ramificações durante a recombinação homóloga. Rad54 funciona na resposta a danos no DNA para resolver lesões associadas à replicação e quebras de dupla fita, sustentando a estabilidade do genoma por meio de vias de reparo nas fases S e G2. Alterações na atividade de RAD54L podem comprometer a fidelidade da recombinação e contribuir para a carga mutacional e para rearranjos cromossômicos observados na biologia do câncer e em contextos hereditários de instabilidade genômica. Por isso, RAD54L é amplamente estudado em mecanismos de estresse replicativo, reparo mediado por recombinação e na escolha de via entre recombinação homóloga e junção de extremidades.

Rad54 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAD54L sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rad54 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAD54L em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAD54L, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rad54. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAD54L nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rad54 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rad54 em células tumorais com expressão de RAD54L silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.